使用Geneious快速定位基因魔剪CRISPR/cas的gRNA位點與脫靶結(jié)合位點[4]
練習3：查找CRISPR位點并檢查脫靶匹配
在之前的練習中，您對LYP1基因上的所有“GN（20）GG”位點進行了與啤酒糖酵母基因組的脫靶結(jié)合的評分?。由于釀酒酵母基因組相對較小并且LYP1基因上僅有少量“GN（20）GG”位點，因此該搜索相對較快。但是，如果您正在測試針對較大基因組（例如，人類基因組）的脫靶結(jié)合和/或?qū)^大數(shù)量的CRISPR位點進行評分，則此搜索可能需要很長時間。在本練習中，我們將使用Find CRISPR位點工具中的其中一種替代搜索策略來丟棄一些網(wǎng)站并加快搜索速度。
選擇LYP1 CDS文檔（geneious的demo數(shù)據(jù)，可以下載）并轉(zhuǎn)到克隆→查找CRISPR位點。
如前面的練習中，在Binding位點旁邊依次選擇Anywhere。在目標類型“GN（19）”?旁邊的字段以及PAM Site字段中鍵入“NGG”。
在本練習中，我們希望使用其中一種替代搜索策略來丟棄具有強大異地匹配的CRISPR位點，因此在“?速度和過濾器”策略下選擇“?快速” - 丟棄更多位點。脫靶數(shù)據(jù)庫仍應(yīng)設(shè)置為酵母基因組文件夾。
對話框現(xiàn)在應(yīng)該如下圖所示。點擊確定運行搜索。
使用這種搜索策略，Geneious僅在該序列中注釋了五個CRISPR位點。
在搜索結(jié)果中，任何發(fā)現(xiàn)與PAM位點中沒有不匹配或在PAM位點旁邊的前8bp內(nèi)發(fā)現(xiàn)有脫靶匹配的位點都將從搜索中刪除。Geneious沒有為這些位點尋找進一步的非目標匹配，CRISPR位點也沒有在序列中注釋。
要從序列中刪除這些注釋，請單擊序列視圖中條目名稱左側(cè)的箭頭，然后選擇刪除條目。
未完，繼續(xù)[5]